"細胞-細胞間交互"三種常見作用方式和研究方法

"細胞-細胞間交互"近年一直是高分文章大受關註領域，以外泌體（或者胞外囊泡）及其成分（如RNA、脂質和蛋白）、線粒體轉移（比如隧道納米管介導的）、配體-受體（比如膜配體、分泌性配體以及膜受體）為代表，倘若你同樣懷有這份興趣，那該怎樣着手深入研究呢？今天重點介紹這三種作用方式的研究方法。

一、外泌體介導的細胞間通訊

外泌體是細胞分泌的納米級囊泡，攜帶蛋白質、RNA等生物分子，通過與受體細胞融合或被內吞，傳遞信號調節其功能。

外泌體的生物發生、降解和分泌

研究方法：

1）外泌體分離、鑒定和表征方法

外泌體分離常用差速超速離心、密度梯度超速離心、過濾、超濾等傳統方法，也可用微珠、微流控芯片等新技術。鑒定時需檢測外泌體的蛋白標誌物，如CD9、CD63、CD81等，常用Western blot。表征包括形態和粒徑分布，可使用透射電子顯微鏡（TEM）、納米顆粒跟蹤分析（NTA）等。

2）外泌體示蹤細胞間傳遞方法

示蹤方法包括荧光染料標記，如PKH26、PKH67等，可直接與外泌體脂質雙層膜結合；核酸標記，將外泌體核酸標記為荧光或放射性探針；蛋白質標記，用GFP等標記外泌體表面蛋白；還可利用磁性納米顆粒標記，通過磁共振成像追蹤。

3）外泌體成分的組學分析

外泌體組學分析主要包括蛋白質組學、轉錄組學和脂質組學。蛋白質組學通過質譜技術分析外泌體中的蛋白質組成；轉錄組學利用高通量測序技術研究外泌體中的RNA種類和表達水平；脂質組學采用質譜技術分析外泌體中的脂質組成。

4）外泌體與受體細胞共培養方法

將提取純化的外泌體加入受體細胞培養液中，通過觀察受體細胞的反應和表型來研究外泌體對受體細胞的影響。此外，也可標記外泌體後進行共培養，實時監測其在受體細胞中的動態變化。

二、線粒體轉移

粒體可通過隧道納米管（TNTs）、細胞外囊泡或直接細胞外釋放等方式從一個細胞轉移到另一個細胞，支持受體細胞的代謝需求。

線粒體從 REC 轉移到受體細胞的路線

研究方法：

1）線粒體分離和鑒定

線粒體分離通常采用差速離心法，先低速離心去除細胞碎片和核，再高速離心沈澱線粒體。鑒定方法包括透射電子顯微鏡（TEM）觀察其雙層膜結構，以及通過特異性抗體（如抗TOM20抗體）進行Western blot檢測。

2）分離線粒體後與細胞共培養

將分離的線粒體加入受體細胞培養液中，通過荧光顯微鏡或流式細胞術觀察線粒體是否被攝取。也可利用化學誘導供體細胞線粒體耗竭後與受體細胞共培養，比較處理前後受體細胞的差異。

3）細胞共培養體系下的線粒體標記和示蹤

使用荧光染料（如MitoTracker）或荧光蛋白（如GFP）標記供體細胞的線粒體，然後與受體細胞共培養。通過荧光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察線粒體在受體細胞中的分布，從而示蹤線粒體轉移。

4）單細胞測序結合MERCI分析

獲取共培養的癌細胞和T細胞的轉錄組數據後，應用MERCI算法識別線粒體突變（mtSNVs）並估計癌細胞中外源線粒體的相對豐度。通過比較突變頻率，確定T細胞特有的突變，將細胞分類為潛在的線粒體供體和受體。並通過計算DNA和RNA排名分數，預測線粒體的受體細胞和供體細胞。

三、配體-受體結合

配體與受體結合後，誘導受體構象變化，激活下遊信號通路，調節細胞功能。

研究方法：

1）阻斷性抗體阻斷受體活化

使用針對受體特定區域的阻斷性抗體，該抗體可特異性結合受體，阻止配體與受體結合，從而抑製受體的活化。通過檢測下遊信號通路的激活情況（如蛋白磷酸化水平），評估阻斷效果，用於研究受體活化的功能和信號傳導機製。

2）中和性抗體降低配體濃度

利用中和性抗體與配體特異性結合，形成抗體-配體復合物，從而降低遊離配體的濃度。通過檢測細胞對配體的反應（如細胞增殖、細胞因子分泌等），評估中和效果，用於研究配體在生理過程中的作用和調控機製。

3）配體-與受體在組織與細胞共培養體系下的染色與共定位

在共培養體系中，分別用荧光標記的抗體對配體和受體進行染色。通過荧光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察兩者的荧光信號，分析其共定位情況。共定位分析可借助軟件計算共定位系數，判斷配體與受體是否在同一細胞區域聚集，從而推斷二者在生理條件下的相互作用。

4）免疫共沈澱驗證配體-與受體結合

將細胞裂解後，加入針對受體的特異性抗體，孵育使抗體與受體結合。再加入蛋白A/G瓊脂糖珠，通過抗體與珠子結合沈澱受體蛋白復合物。最後通過Western blot檢測沈澱物中是否存在配體蛋白，若檢測到配體，則說明二者在細胞中存在結合。

5）表面等離子共振檢測配體-受體結合強度

將受體固定在SPR芯片表面，配體在流動相中通過芯片表面。SPR技術可實時監測配體與受體結合過程中的折射率變化，從而獲得結合親和力（KD）、結合速率常數（ka）和解離速率常數（kd）等動力學參數，用於定量分析二者的結合強度。

6）分析配體與受體結合後受體構象改變

通過圓二色光譜（CD）或核磁共振（NMR）等技術，檢測受體在結合配體前後的構象變化。CD可分析二級結構變化，NMR可提供更詳細的三維結構信息。此外，也可利用荧光共振能量轉移（FRET）技術，通過荧光標記的探針檢測受體內部距離變化，間接反映構象改變。