DSHB於1986年由國家兒童健康與人類發展研究所建立，自1997年起設在愛荷華大學，其使命是作為國際研究界的抗體資源。目標始終不變：為科學進步儲存雜交瘤和單克隆抗體。

產品形式說明

上清液（-s）

由雜交瘤細胞條件培養基構成，主要成分為無動物源成分（ADCF）的單克隆抗體生長培養基。雜交瘤培養初期殘留的胎牛血清（FBS）濃度低於1.5-2.0%，且未添加牛血清白蛋白（BSA）作為抗體穩定劑。

濃縮液（-c）

通過50kD超濾膜製備，雖非純化抗體，但免疫球蛋白含量為上清液的10倍。換算關系為：100ul濃縮液≈1ml上清液的抗體量。推薦僅用於需高濃度小體積抗體的實驗（如免疫沈澱、顯微註射或抗體偶聯）。常規免疫染色/印跡實驗建議優先選用上清液。

純化單抗（-y）

供應量有限，具體推薦稀釋比例詳見網站各抗體頁面的提交者註釋。產品標簽標註抗體濃度，技術資料可從官網下載。

例如：

凍存細胞（-f）

每管1ml凍存液含5×10⁶至1×10⁷個細胞，幹冰運輸。接收後需立即復蘇培養或轉入液氮長期保存。

活細胞（-g）

由單支凍存管復蘇擴增而來，含2×10⁷至4×10⁷個活細胞。經質檢確認生長狀態良好後，以T25培養瓶（含65ml培養基）形式運輸。收貨後需立即轉入培養箱繼續培養。

關鍵生物參數說明

FBS殘留量：<2%的濃度設計既保留必要生長因子（如胰島素、轉鐵蛋白），又最大限度降低動物源成分幹擾

超濾標準：50kD截留分子量確保有效富集IgG類抗體（分子量~150kD）

細胞活率保障：凍存細胞采用程序降溫（-1℃/min）結合90%FBS+10%DMSO凍存液，活細胞運輸時培養基含15%特級胎牛血清（經70項質控檢測）

（註：實際應用中建議對濃縮液進行Bradford法蛋白定量驗證，活細胞培養時需維持37℃、5%CO₂的恒溫恒濕環境）

產品儲存建議

最佳儲存確保抗體活性隨時間保持。對於立即使用，建議在4°C下短期儲存長達兩周。如需長期保存，應將溶液分裝成不小於20ul的體積，在-20°C或-80°C冷凍。小體積的等分液應能提供足夠的試劑供短期使用。應避免凍融循環。對於濃縮物或生物反應器產品，可在冷凍前加入等量的甘油（一種冷凍保護劑）。

產品使用建議

每種應用的最佳免疫球蛋白（Ig）濃度因物種和抗體親和力而異。對於每種產品，最終用戶實驗室必須針對每種應用優化抗體滴度。使用小鼠 Ig 進行免疫組織化學（IHC）、免疫荧光（IF）和免疫細胞化學（ICC）時，良好的起始濃度為 2 - 5 ug/ml。對於蛋白質印跡（WB），推薦的小鼠 Ig 濃度範圍為 0.2 - 0.5 ug/ml。通常，兔抗體具有更高的親和力，在初始測試時使用的 Ig 濃度要低得多。兔 Ig 的推薦濃度為：0.2 - 0.5 微克/毫升（IF、IHC 和 ICC）和 20 - 50 ng/ml（WB）。

一、產品問題

問：你們的試劑盒可以用於診斷目的嗎？ 

答：我們目前所有的檢測試劑盒僅用於研究目的，不能用於診斷。

問：一個試劑盒可以進行多少次測試？ 

答：試劑盒的總測試次數可以在目錄編號中找到。例如，QuantiChrom™肌酐檢測試劑盒（目錄編號DICT-500）足夠在96孔板中進行500次測試。試劑盒的大小指的是標準96孔格式下的總測試次數，包括樣品以及所需的對照品和標準品。

問：檢測是否具有物種特異性？ 

答：BioAssay Systems的大多數生化檢測試劑盒不具有物種特異性，已測試過人類、小鼠、大鼠、牛等樣本。在極少數情況下，不同物種的酶的生化特性可能需要對協議進行調整，例如改變pH值，才能進行檢測。

問：可以使用哪些類型的樣本？ 

答：通常，我們的檢測可以用於多種類型的樣本，包括生物、食品、飲料和環境樣本，前提是存在合適的樣本製備方法。通常，感興趣的分析物應為澄清液體或易於提取到澄清液體中，最好是水溶液。

問：在哪裏可以找到試劑盒的有效期？ 

答：有效期因具體試劑盒而異。請閱讀檢測協議或訪問我們的網站（www.bioassaysys.com）並搜索您感興趣的試劑盒。有效期從交付日期開始計算。-yu8fs6b0y4cq6dv4as2t9w8c10ac41dl70c7wf.xn--tlqud5a264gokgt6jr5av7dyfe6578c0h0b./)

問：每次檢測運行是否需要使用標準品或標準曲線？ 

答：是的，強烈建議使用。

問：你們的一些檢測試劑盒既可以用荧光法也可以用比色法。我應該使用哪種方法？ 

答：這取決於您的設備。荧光檢測通常比比色檢測靈敏度高10倍以上。這意味着如果您使用荧光檢測，可以使用更少的樣本，這在樣本量有限的情況下非常理想。

問：我可以將未使用的試劑儲存起來以備將來使用嗎？ 

答：可以，未使用的試劑可以根據檢測協議儲存。應避免試劑的反復凍融循環。

問：在哪裏可以找到使用你們產品的出版物參考文獻？ 

答：引用文獻可以在我們的網站上找到，網址為http://www.bioassaysys.com/support.php。如果您搜索您感興趣的產品，可以點擊“出版物”鏈接查看引用列表。每種產品的引用文獻都會定期更新。

問：什麽是檢測限（LOD）？它與定量限（LOQ）有什麽區別？ 

答：在分析化學中，檢測限（LOD）是指可以與空白值區分開來的最低物質含量。檢測限通常根據空白值的均值、標準偏差和置信因子來估算。通常，LOD定義為3倍空白值的標準偏差。定量限（LOQ）的確定方法與LOD類似，但定義為10倍空白值的標準偏差。

問：為什麽我的讀數與你們的檢測協議上的數據不同？ 

答：讀數可能會因多種因素而不同：您的儀器（分光光度計、酶標儀）和配件（濾光片或單色器）、板的類型（透明、白色或黑色）及其幾何形狀（圓形孔、方形孔、平底或V形底）以及移液的準確性。因此，強烈建議在每次檢測運行中與樣品一起運行標準品。

二、設備和配件

問：我沒有酶標儀，可以用我們的分光光度計和比色皿代替嗎？ 

答：可以。我們的檢測可以在所有使用比色皿的分光光度計或使用微孔板（如96孔板）的酶標儀上進行。大多數檢測可以根據比色皿、96孔或384孔格式的不同體積進行調整。

問：如何將微孔板格式的測試數量轉換為比色皿格式？ 

答：轉換取決於比色皿的大小和96孔板中檢測的最終體積。例如，對於DICT-500，96孔格式的最終體積為205 μL。對於1 mL比色皿，5個孔相當於1個比色皿。因此，1 mL比色皿的檢測次數為500 ÷ 5 = 100次/試劑盒。或者，如果使用小體積比色皿（例如可容納200 μL體積的比色皿），可以使用與96孔板相同的體積。

問：推薦使用哪種板進行檢測？ 

答：對於比色檢測，使用透明平底板進行光密度（OD）測量。對於荧光檢測，推薦使用黑色板。對於發光檢測，使用白色不透明板。

問：檢測協議建議在550-620 nm讀取，但我最接近的濾光片是540 nm。我還能在酶標儀上運行檢測嗎？

答：我們通常建議在檢測按規格工作範圍內使用波長。我們不建議在給定範圍外測量，因為檢測的靈敏度通常會降低。在某些情況下，在狹窄的波長範圍外進行準確測量是不可能的。

問：我應該使用哪個濾光片來測量發光？ 

答：使用我們的檢測進行發光檢測時，不需要使用濾光片。

三、樣本處理

問：我的樣本很渾濁。我還能使用它嗎？ 

答：所有樣本都應該是澄清的，沒有沈澱物或顆粒。如果有顆粒，應通過離心（例如14,000 rpm離心5分鐘）或通過0.45 μm濾器過濾來去除。

問：我今天不能進行檢測。樣本可以冷凍嗎？ 

答：原則上，建議使用新鮮製備的樣本進行檢測。然而，大多數分析物在適當儲存（例如4°C、-20°C、-80°C或液氮中）時是穩定的。

問：我應該使用血清樣本還是血漿樣本？ 

答：通常，血清樣本比血漿樣本更受歡迎，因為血清樣本中不含抗凝劑。然而，對於我們的大多數檢測，可以使用血清或血漿。

問：如果數據表中沒有描述，如何為檢測製備細胞和組織樣本？ 

答：樣本製備方法可能因樣本類型和分析物而異。建議查閱相關文獻。以下是一般指南，適用於大多數情況：

組織樣本：從20-100 mg組織開始，加入200-1000 μL冰冷的PBS。通過在冰上使用Dounce勻漿器（10-20次）或在冰水浴中進行超聲處理來實現組織裂解。可以在顯微鏡下檢查組織裂解程度。以14,000 g離心10分鐘。將澄清的上清液轉移到幹凈的管中。最好對不同稀釋度的樣本進行預測試。選擇讀數在標準曲線檢測範圍內的稀釋度進行進一步檢測。大多數樣本如果未立即檢測，可以儲存在-80°C。

細胞樣本：將約兩百萬（2 × 10^6）收獲的細胞在冰上懸浮在400 μL PBS中。通過在冰上使用Dounce勻漿器（10-20次）或在冰水浴中進行超聲處理來實現細胞裂解。可以在顯微鏡下檢查細胞裂解程度。以14,000 g離心10分鐘。將澄清的上清液轉移到幹凈的管中。最好對不同稀釋度的樣本進行預測試。選擇讀數在標準曲線線性範圍內的稀釋度進行進一步檢測。大多數樣本如果未立即檢測，可以儲存在-80°C。

如果要使用裂解緩沖液，建議先進行檢測以測試裂解緩沖液中的成分是否幹擾檢測。這可以通過運行兩個標準曲線來實現：一個在H2O（或數據表要求的緩沖液）中製備，另一個在與樣本相同比例的裂解緩沖液中製備。如果兩個標準曲線相同，則沒有幹擾，可以安全使用裂解緩沖液。如果標準曲線有差異，仍然可以使用裂解緩沖液，前提是標準曲線保持線性；然而，用於分析裂解樣本的標準曲線需要在裂解緩沖液中製備。

問：我應該使用多少樣本進行檢測？ 

答：對於未知樣本，應進行預測試以評估最佳稀釋度。製備樣本的系列稀釋，並選擇讀數在檢測範圍內的稀釋度（理想情況下在標準曲線的中間）。然後按此稀釋因子稀釋樣本並重新運行檢測，將結果乘以稀釋因子。

四、訂購、運輸、接收和儲存

問：你們的產品是冰運的嗎？ 

答：有些產品在室溫下運輸，而有些產品則在冰墊或幹冰上運輸（這適用於目錄編號以字母“E”開頭的試劑盒，例如ETGA-100）。

問：我們如何從國外購買你們的產品？ 

答：我們建議您聯系您所在國家或附近的國家的分銷商（http://www.bioassaysys.com/distributors.php）。如果您的國家未列出，您可以直接從我們這裏訂購。請在下訂單前聯系我們（info@bioassaysys.com）。

問：我收到試劑盒後應該做什麽？

答：立即打開試劑盒並確定適當的儲存條件。請參考檢測協議中的“試劑盒內容”下的“儲存條件”。相應地儲存試劑盒組件。

【缺氧探針】Hypoxyprobe正確使用 FAQs

常見問題解答（FAQs）：

註：Pimonidazole：吡莫硝唑

1.問：什麽是 pimonidazole HCl（Hypoxyprobe-1）的最佳溶劑？

答：pimonidazole HCl 是弱堿 pimonidazole 的鹽酸鹽，在水溶液中非常易溶，包括中性緩沖鹽水（116 mg/mL 或 400 mmol）。這允許在動物研究中使用小體積（0.1-0.5 mL）進行腹腔內或靜脈註射 pimonidazole HCl。

2.問：用於缺氧標記的 pimonidazole HCl 劑量應該是多少？

答：pimonidazole HCl 在缺氧組織中的結合程度將取決於生物還原激活的速率以及組織對 pimonidazole HCl 的接觸程度（接觸 = 濃度 x 時間）。還原代謝的速率很難預測，但可以檢查接觸的影響。在以下計算中，濃度以 pimonidazole HCl（分子量 290.7）為單位給出。

體外接觸於 58mg/kg（培養基中的濃度）1 小時的球狀體觀察到強烈的缺氧染色。接觸 = 58mg/kg x 1 小時 = 58mg/kg-小時。

在人體中，使用 0.5gm/m²（約 14mg/kg）的劑量可以獲得腫瘤組織和正常上皮中的強染色，其中 pimonidazole 的血漿半衰期為 5 小時。接觸 = 14 mg/kg x 5 小時 = 70 mg/kg-小時。

在小鼠腫瘤組織中，使用 60 mg/kg 可以獲得缺氧的強染色，其中 pimonidazole 的血漿半衰期為 0.25 小時。接觸 = 60mg/kg x 0.25 小時 = 15 mg/kg-小時。

總結來說，對於體型統一的小動物，如實驗室大鼠和小鼠，推薦使用 60 mg/kg 體重的 pimonidazole HCl 劑量，這是效果和經濟性之間的良好平衡。在小鼠和大鼠中使用了 30 mg/kg 至 400 mg/kg 的劑量，沒有毒性或由於血流效應導致的氧氣水平改變，但使用超過 100 mg/kg 的 pimonidazole 劑量時，觀察到在小鼠後腿植入的腫瘤中出現血流效應。因此，在使用後腿腫瘤模型時，劑量 > 100 mg/kg 必須小心。對於體型不均勻的較大動物，劑量通常基於表面積計算。對於人類，推薦劑量為 0.5 gm/m2，而狗的使用劑量為 0.28 gm/m2。

3.問：Hypoxyprobe-1 是否能穿透缺氧的大腦和腦腫瘤組織？

答：盡管 Hypoxyprobe-1 是水溶性的，但其相應的遊離堿（pimoindazole）具有 8.5 的辛醇-水分配系數，因此該標記物可以自由穿透大腦和腦腫瘤組織。

大鼠腦腫瘤冰凍切片的免疫荧光染色。大鼠腦腫瘤冰凍切片的免疫荧光染色。血管：ME 9F1；紅色。缺氧：Pimonidazole 加合物；綠色。灌註：Hoechst 33342；藍色。正常大腦（N）和腫瘤組織（T）。原始放大倍數為 x 200。註意正常大腦中血管的規則模式與腫瘤組織中血管的無序排列（Bernsen et al, Journal of Neurosurgery 93: 449-454, 2000; by permission）。

4.問：pimonidazole HCl 是檢測體內缺氧的最佳探針嗎？

答：pimonidazole HCl，即“金標準”免疫組化缺氧標記物，具有真正的優勢，包括高水溶性（在鹽水中為 116 mg/mL），允許以小體積註射 ip 或 iv 給藥。像六氟化 CCI-103F 這樣的標記物水溶性為 10 毫摩爾或更低，通常作為 ip 花生油和 DMSO 的乳液給藥，以避免血液稀釋。

固體 pimonidazole HCl 在室溫或 4°C 下非常穩定（多年）。在 4°C 下避光保存的 pimonidazole HCl 濃縮水溶液也非常穩定（多年）。小鼠和兔子對 pimonidazole 加合物的抗體在 4°C 下保存至少一年穩定。

小鼠中 pimonidazole 的 LD50(7天) 為 728 mg/kg，將其歸類為低毒性的非危險品。

盡管 pimonidazole HCl 非常水溶性，但作為遊離堿的 pimonidazole 具有 8.5 的高辛醇-水分配系數，並且容易穿透所有組織，包括大腦。實際上，它在大多數組織中的積累比血漿水平高 3 倍，使其有效的組織濃度遠高於其他 2-硝基咪唑缺氧標記物。

Pimonidazole 的結合可以通過多種技術檢測，包括：冷凍固定組織切片中的免疫荧光；福爾馬林固定石蠟包埋組織切片中的免疫過氧化物酶染色；ELISA；或流式細胞術。

5.問：單克隆抗體對 pimonidazole 加合物是否可以用於小鼠組織？

答：是的。對於福爾馬林固定石蠟包埋的組織，我們推薦使用過氧化物酶 F(ab)2 二級抗體策略（見產品手冊），它提供了非常幹凈的背景，適用於多種動物物種。

6.問：pimonidazole HCl 激活和結合到缺氧細胞的機製是什麽？

答：Varghese et al.表明，缺氧細胞將 2-硝基咪唑結合到肽硫醇，如谷胱甘肽。目前對 pimonidazole 代謝的看法總結在下面的方案中。O₂ 與 pimonidazole 的第一個電子的添加競爭，這解釋了激活和結合的 pO2 依賴性。根據試管實驗，估計大約 20% 的活化 pimonidazole 結合到細胞硫醇上，大約 80% 不結合但通過與水的反應而斷裂。Pimonidazole 受氧化代謝的影響，導致容易排泄的 N-氧化物、硫酸鹽和葡萄糖醛酸衍生物（ST = 硫酸轉移酶；GT = 葡萄糖醛酸轉移酶）。這些氧化途徑似乎不影響 pimonidazole 作為缺氧標記物的效用。

7.問：Hypoxyprobe 試劑盒中提供的 IgG1 抗體濃度是多少？

答：Hypoxyprobe-1 試劑盒中提供的耗盡雜交瘤溶液中小鼠 IgG1 單克隆抗體的濃度約為 60 ug/mL。

Hypoxyprobe-1 Plus 試劑盒中的 FITC 偶聯 MAb；Hypoxprobe-1 Green 試劑盒；Hypoxyprobe-1 Red549 試劑盒；Hypoxyprobe-1 RedAPC 試劑盒；和 Hypoxyprobe-1 Biotin 試劑盒中的親和純化 IgG1 的濃度約為 500 ug/mL。

親和純化的兔子抗血清對 pimonidazole 加合物和未純化的兔子抗血清對 Hypoxyprobe-F6（CCI-103F）加合物中的活性 IgG 分子的濃度未知。

8.問：pimonidazole 結合是否能檢測慢性和急性缺氧？

答：在固體組織中發生兩類缺氧 - 擴散限製的慢性缺氧和灌註限製的急性缺氧。慢性缺氧出現在由靠近血管的細胞消耗氧氣而產生的氧梯度的遠端，腫瘤的情況是由血管樹中的 pO2 縱向梯度引起的局部氧氣供應不足而加劇的（ Dewhirst et al., Temporal changes in pO2 of R3230AC tumors in Fischer-344 rats, Int J Radiat Oncol Biol Phys 42: 723-726, 1998）。慢性缺氧的存在意味着組織中的細胞以與氧氣供應無關的速率消耗氧氣，從而在遠離血管的微小區域將 pO2 推向非常低的水平。也就是說，大多數細胞具有“調節”的細胞表型特征，通過平穩過渡到基於糖酵解的能量產生而適應低 pO2（Dewhirst et al., Temporal changes in pO2 of R3230AC tumors in Fischer-344 rats, Int J Radiat Oncol Biol Phys 42: 723-726, 1998）。

與具有靜態、代謝控製的 pO2 梯度的慢性缺氧相比，急性缺氧與由血流不穩定性引起的 pO2 波動相關，腫瘤的情況是由短暫的血管阻塞造成的。急性缺氧的腫瘤細胞，由於是增殖的，可能比靜止的、慢性缺氧的細胞在治療上更相關。在正常組織中，波動的缺氧與缺氧再灌註損傷相關。關於 pimonidazole 是否能檢測到慢性和急性缺氧，結合弱堿性取代基（pKa ≥ 8.0）的化合物在組織中濃縮約 3 倍於循環血水平。弱堿性化合物的這種性質是基於細胞內外 pH 差異對弱堿性化合物細胞內濃度的影響。特別是，在 pH 7.4 時，弱堿性 2-硝基咪唑在細胞內的濃度比細胞外濃度高 2 倍。這種濃度增加直接反映在缺氧細胞的放射增敏和用缺氧標記物標記的增加上。因為經歷波動缺氧的細胞靠近血管並且 pH 相對較高，弱堿性、2-硝基咪唑缺氧標記物如 pimonidazole 在這些細胞中濃縮，因此急性缺氧發作導致與缺乏弱堿性官能團的缺氧標記物相比，結合水平更高。通過這種方式，pimonidazole 及其類似物在檢測急性缺氧方面更優越（Kleiter, et al. A comparison of oral and intravenous pimonidazole in canine tumors using intravenous CCI-103F as a control hypoxia marker. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 64: 592-602, 2006 for further discussion and literature cited）。

9.問：在 pimonidazole HCl 給藥後多久可以收獲感興趣的組織？

答：在收獲過程中組織變得缺氧，循環中的 pimonidazole 結合可能會在原則上給出缺氧的錯誤測量。答案在於比較標記和收獲期間組織對 pimonidazole 的接觸程度。接觸（pimonidazole 濃度 x 37°C 下的時間）在標記期間很大，在收獲期間非常短，因為 pimonidazole 濃度限於收獲時組織中的濃度。低標記濃度、快速收獲和立即在冷介質中固定將消除可測量的非特異性結合水平。

在人類腫瘤研究中，活檢通常在 pimonidazole HCl 輸註後 16-24 小時進行。人類中 pimonidazole 的血漿半衰期約為 5 小時，因此 16 到 24 小時代表循環 pimonidazole 的 3 到 5 個血漿半衰期。這意味着在收獲時 pimonidazole 的初始濃度為 1/8 到 1/32。這與活檢材料快速轉移到冷固定劑相結合，最小化了非特異性 pimonidazole 結合，如大多數靠近血管的細胞的低背景結合所示。

在一些人類腫瘤研究中，活檢在 pimonidazole HCl 輸註後 1.5 到 4 小時進行，並立即在液氮中固定。這種方法也給出了靠近血管的細胞的低背景結合。盡管在輸註後 1.5 到 4 小時循環中的 pimonidazole 水平相對較高，但收獲的組織中對 pimonidazole 的接觸與體內標記期間對 pimonidazole 的接觸相比非常短。

人類腫瘤的經驗可以指導實驗研究。小鼠中 pimonidazole 的血漿半衰期通常為 0.25 小時。在這種情況下，收獲時間為 1-2 小時，與快速加入冷固定劑相結合，有效地消除了非特異性結合。這一結論對於涉及二氧化碳窒息的實驗尤為重要，因為全局缺氧的持續時間定義不清。更快速的安樂死技術適用於較短的收獲時間，只要進行快速組織收獲並在冷固定劑中固定。

10.問：為什麽將 pO2 阈值 ≤ 10 mmHg 設置為 pimonidazole 結合的基礎？

答：在固體組織中測量 2-硝基咪唑結合的 Km(O2) 是困難的。迄今為止最好的實驗是 Gross 等人。在固體組織球狀體模型中，通過放射自顯影測量放射性標記的 misonidazole 結合，與氧微電極測量的 pO2 進行比較。由於 misonidazole 結合導致的顆粒密度在 10 mm Hg 以下急劇增加（Gross et al. Calibration of misonidazole labeling by simultaneous measurement of oxygen tension and labeling density in multicellular spheroids, Int. J. Cancer 61: 567-573, 1995）。Chou 等人發現 pimonidazole 結合的 Km(O2) 與 HeLa 細胞中的 misonidazole 類似，並得出結論，10 mm Hg 也是固體組織中 pimonidazole 結合的合理阈值（Chou et al. Evidence that involucrin, a marker for differentiation, is oxygen regulated in human squamous cell carcinomas. Br. J. Cancer, 90: 728-735, 2004）。

固體組織的一個特征在稀疏的細胞培養中是不存在的，即氧氣消耗創造了非常陡峭的 O₂ 梯度，以至於不同 Km(O₂₎ 被穿越的距離被縮短。例如，在肝組織中觀察到陡峭的 pO2 梯度，其中 pimonidazole 加合物的免疫染色從背景到強烈染色僅跨越幾個細胞直徑。與組織中存在陡峭的 pO2 梯度一致的是，氧氣調節蛋白如 involucrin 和碳ic anhydrase IX 的免疫染色模式與 pimonidazole 結合的模式非常相似，盡管氧氣調節蛋白的 Km(O₂) 約為 15 mm Hg，而體外 pimonidazole 結合的 Km(O₂) 為 2-4 mm Hg（Chou et al. Evidence that involucrin, a marker for differentiation, is oxygen regulated in human squamous cell carcinomas. Br. J. Cancer, 90: 728-735, 2004 for further discussion）。

11.問：關於小鼠中 pimonidazole 藥代動力學有哪些已知信息？

答：

1. Stratford et al. Pharmacokinetic studies of some novel (2-nitro-1-imidazolyl) propanolamine radiosensitizers. In: A. Breccia, C. Rimondi, and G. E. Adams (eds.), Advanced Topics on Radiosensitization of Hypoxic Cells, pp. 165-169. New York: Plenum, 1982.

2. Williams et al. In vivo assessment of basic 2-nitroimidazole radiosensitizers. Br J Cancer, 46: 127-137, 1982.

3. Walton et al. The reversible N-oxidation of the nitroimidazole radiosensitizer Ro 03- 8799. Biochem Pharmacol, 34: 3939-3940, 1985.

4. Walton et al. The effects of whole body hyperthermia on the pharmacokinetics and toxicity of the basic 2-nitroimidazole radiosensitizer Ro 03-8799 in mice. Br J Cancer, 55: 469-476, 1987.

5. Walton et al. Effects of localised tumour hyperthermia on pimonidazole (Ro 03-8799) pharmacokinetics in mice. Br J Cancer, 59: 667-673, 1989.

6. Workman, P. Accelerated elimination of pimonidazole following microsomal enzyme induction in mice: a possible approach to reduced neurotoxicity of the pimonidazole-etanidazole combination. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 16: 1011-1014, 1989.

12.問：體內 N-氧化是否會影響 pimonidazole 作為缺氧標記物？

答：pimonidazole 中的哌啶基團很容易被氧化成其 N-氧化物代謝物。原則上，這可能會影響 pimonidazole 作為缺氧標記物的有效性。（Arteel et al. Reductive metabolism of the hypoxia marker pimonidazole is regulated by oxygen tension independent of the pyridine nucleotide redox state. Eur J Biochem, 253: 743-750, 1998 for a detailed discussion of the metabolism of pimonidazole）。在體內，pimonidazole N-氧化物是通過黃素單加氧酶（FMO）的作用形成的。FMO 同工酶的分布因物種而異，產生不同的 N-氧化物血漿水平。有趣的是，pimonidazole 給藥的途徑（iv 或口服）對 N-氧化物的血漿水平影響很小（Kleiter et al. A comparison of oral and intravenous pimonidazole in canine tumors using intravenous CCI-103F as a control hypoxia marker. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 64: 592-602, 2006 for further discussion）。像過氧亞硝酸鹽這樣的強氧化劑，由超氧陰離子與一氧化氮（NO）反應形成，也可以氧化 pimonidazole。然而，N-氧化物的形成似乎並沒有損害 pimonidazole 作為缺氧標記物的有效性。

首先，N-氧化物的形成可以通過血液中的血紅蛋白-鐵復合物的還原作用以及組織還酶如黃嘌呤脫氫酶和還原型細胞色素 P-450 來逆轉，從而限製了 pimonidazole 因氧化而丟失（Walton et al. The reversible N-oxidation of the nitroimidazole radiosensitizer Ro 03- 8799. Biochem Pharmacol, 34: 3939-3940, 1985）。

其次，通過使用第二種缺氧標記物，已經表明 pimonidazole 標記的缺氧程度與推薦用於缺氧標記的 pimonidazole 血漿濃度無關。

第三，因為 pimonidazole 及其 N-氧化物衍生物對 anti-pimonidazole 抗體沒有交叉反應性，N-氧化物不會幹擾缺氧組織中 pimonidazole 加合物的檢測（Kleiter et al. A comparison of oral and intravenous pimonidazole in canine tumors using intravenous CCI-103F as a control hypoxia marker. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 64: 592-602, 2006 for further discussion）。

13.問：如果 pimonidazole 染色模式似乎與組織缺氧不一致怎麽辦？

答：到目前為止，pimonidazole 加合物的免疫染色模式通常與組織缺氧的存在一致。然而，英國病理學家 Leon Cobb 曾經質疑，例如肝臟中心區域的高濃度硝基還原酶是否可能壓倒 pimonidazole 結合的氧氣抑製，並導致對該區域缺氧存在的錯誤的結論。我們通過檢查大鼠肝臟中心區域在正常（順行）和反向（逆行）灌註中 pimonidazole 的結合來應對這一重要挑戰（Arteel et al. Evidence that hypoxia markers detect oxygen gradients in liver: pimonidazole and retrograde perfusion of rat liver. Br J Cancer, 72: 889-895, 1995）。逆行灌註導致中心靜脈周圍的肝臟區域氧化，而門靜脈周圍的區域缺氧。如果中心區域的高濃度氧化還原酶導致 pimoindazole 在氧氣存在下結合，那麽我們將期望在逆行灌註期間看到中心區域高水平的 pimonidazole 結合。實際上，逆行灌註將 pimonidazole 結合從氧化的中心區域轉移到現在缺氧的門靜脈周圍區域，明確表明中心區域的高濃度細胞色素氧化還原酶本身並不取消 pimonidazole 結合的氧氣抑製。這一概括的一個有趣的例外是圍繞中心靜脈的單層細胞。導致這些細胞在氧氣存在下 pimonidazole 結合的生物化學仍然是一個谜。可能是它們具有硝基還原酶，有效地將還原當量（電子，氫化物離子）轉移給硝基咪唑缺氧標記物，通過兩個電子步驟，分子氧不能攔截它們。“二氫吡啶”就是這樣一種酶，研究者在進入新領域時必須註意這一警告，關於 pimonidazole 結合。可以想象，例如，炎癥細胞可以在沒有組織缺氧的情況下結合 pimonidazole。首先，炎癥細胞可以具有以對氧氣不敏感的方式減少 pimonidazole 的硝基還原酶。此外，炎癥細胞可以以足夠高的速度消耗氧氣以產生細胞內缺氧。在未標記細胞的海洋中標記的單個炎癥細胞肯定會引起人們對標記細胞是否缺氧的擔憂。

與 Cobb 的擔憂類似，一些研究者詢問，將細胞驅動到還原狀態的高濃度 NADH 和 NADPH 是否可能取消 pimonidazole 結合的氧氣抑製。答案再次是，不，在推薦的用於缺氧標記研究的 pimonidazole 濃度下（Arteel et al. Reductive metabolism of the hypoxia marker pimonidazole is regulated by oxygen tension independent of the pyridine nucleotide redox state. Eur. J. Biochem., 253: 743-750, 1998）。

一般來說，當 pimonidazole 結合的機製受到質疑時，有意識地操縱感興趣的組織的缺氧是有用的。一種技術是讓動物在 pimonidazole 接觸期間呼吸 10% 的氧氣。如果 pimonidazole 結合的程度超過了在空氣中呼吸的動物，那麽很可能缺氧是 pimonidazole 結合的原因。Parliament 及其同事在研究 misonidazole（pimonidazole 的密切相關類似物）的組織缺氧時利用了這種方法（Parliament et al. Nitroimidazole adducts as markers for tissue hypoxia: mechanistic studies in aerobic normal tissues and tumour cells. Br. J. Cancer, 66: 1103-1108, 1992）。使用“二氫吡啶”抑製劑，他們證明 misonidazole 的結合並非由於氧氣不敏感的“二氫吡啶”型硝基還原酶的存在。同樣，當通過氧氣呼吸、碳酸氫鹽呼吸、肼屈嗪註射或組織夾閉有意識地操縱腫瘤缺氧時，觀察到 pimonidazole 結合和氧微電極測量之間有很好的相關性（r² = 0.85）（Raleigh et al. Comparisons among pimonidazole binding, oxygen electrode measurements, and radiation response in C3H mouse tumors. Radiat Res, 151: 580-589, 1999）。

還可以使用雙重標記方法（見 Hypoxyprobe Gemini Kit）來檢測改變組織 pO2 的幹預措施之前和之後的單個組織中的變化。Van der Kogel 及其在尼姆根的團隊在動物腫瘤中使用這兩種標記物，pimonidazole pimonidazole HCl（Hypoxyprobe-1）和 CCI-103F（Hypoxyprobe-F6（Ljungkvist et al. Changes in tumor hypoxia measured with a double hypoxic marker technique. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 48: 1529-1538, 2000）。

GERBU公司在原材料采購和製造領域有超過25年的豐富經驗。GERBU提供廣泛的精細化學品，生物試劑，緩沖液，洗滌劑，介質等。例如ACES、AEBSF、白蛋白、氨苄青黴素、抗生物素蛋白、DTT、甘氨酸、HEPES、IPTG、煙酰胺衍生物等。GERBU完美的生物相容性佐劑已經越來越成為單克隆和多克隆抗體生產的標準。

以下為GERBU佐劑的一些常見問題解答：

混合抗原肽FAQ:

Question：抗原-佐劑混合物是如何製備的?

Answer：將抗原溶液與佐劑按1:1的體積比加入無菌試劑瓶中，搖勻。避免泡沫形成。每只動物使用一根單獨的無菌針。

Question：註射的最佳pH值是多少?

Answer：GERBU佐劑的pH值範圍為5.6 - 5.8。推薦註射pH值為7.0-7.3。

Question：推薦使用哪些緩沖液?

Answer：我們推薦10 ~ 25 mM (pH = 7.3)範圍內的Tris作為緩沖液。確切的濃度取決於蛋白質(抗原性)。

Question：根據說明書，應避免使用多價緩沖液(磷酸鹽/柠檬酸鹽)。助劑會絮凝嗎?

Answer：如果可能的話，使用水(去礦化水)來稀釋抗原。聚陰離子化合物會導致沈澱。如果不可避免，使用盡可能少的PBS。註射前請確保抗原/佐劑混合物沒有凝固。

Question：我的抗原是稀溶的。你推薦哪種溶劑?

Answer：乙醇。將不溶於水的抗原溶解在乙醇中。然後用合適的水緩沖體系將乙醇預溶液緩慢稀釋至10倍體積，再與佐劑配製成1:1的混合物。請不要超過5%乙醇的終濃度。

Question：哪些添加劑和溶劑不應該使用?

Answer：我們強烈建議不要註射變性劑(如SDS，尿素)和螯合劑(如EDTA)，以及大分子緩沖物質(如HEPES)。

抗原特性FAQ

Question：蛋白質復合物的非共價鍵被破壞了嗎?

Answer：蛋白質的四級結構不受影響。通過這種方式，可以保留功能並相應呈現特定的表位。

Question：GERBU佐劑是否與細胞或DNA作為抗原混合?

Answer：您可以將GERBU佐劑與DNA或任何質粒混合。

Question：是否有將牛血清白蛋白溶解為抗原的處方?當必須使用弱抗原性的小分子進行免疫時，GERBU佐劑是否適合作為BSA的載體蛋白?

Answer：BSA作為小分子載體，增強抗原的抗原性和小分子表位的呈現。將500 mg粉狀牛血清白蛋白溶於0.5 ml水(50% w / v)中，或350 mg牛血清白蛋白溶於0.65 ml 0.85% NaCl (35% w / v)中，配製成透明可給藥的混合物。在免疫過程中，事先將這些溶液與GERBU佐劑直接按1:1的體積比混合。

Question：對於抗原性較弱的抗原，如何改進檢測結果?

Answer：弱抗原比強抗原需要更有效的免疫啟動物。但免疫時使用的抗原劑量不宜過高，以免宿主動物對抗原產生免疫耐受。建議更頻繁地加強註射。

Question：有關於蛋白質結合能力的信息嗎?

Answer：具體問題請聯系技術支持。

註射FAQ

Question：免疫過程是如何進行的?

Answer：將免疫懸液置於室溫或體溫(20°C至37°C)。確保它不含任何大顆粒。使用無菌註射設備，將劑量緩慢地註入每個免疫部位。該應用是皮下實施到皮下脂肪組織。如果可能的話，在個體上形成一個皮膚褶皺，以便在那裏註射。請按照相應的使用說明註射部位的數量和各自的最大體積。

Question：幼齡動物可以服用多少劑量?

Answer：根據方案與其他動物進行體重比較。

Question：也可以肌肉註射嗎?

Answer：肌肉內註射通常是耐受良好的，但我們不建議這樣做，因為它會給動物帶來更多的壓力。雞可能會停止下蛋。

Question：為什麽不靜脈註射GERBU佐劑?

Answer：靜脈註射違反了動物福利法。它不會提高整體效率。

Question：註射部位是否有免疫反應?

Answer：復合疫苗的作用可能有延遲效應，短期免疫原性反應是可能的。佐劑建立了一個倉庫，並在皮膚下保持可見的短時間。

保質期FAQ

Question：GERBU佐劑保存在冰箱(4-8°C)中，原始包裝未打開。在那裏，可以看到細小的沈澱和凝集，並且看起來很粘稠。這個產品還可以註射嗎?

Answer：GERBU佐劑自生產之日起穩定3年(2-8°C)。如果GERBU佐劑在不攪拌的情況下長時間存放在陰涼的地方，成分可能會分離和結晶。這對產品質量沒有影響。一旦被帶到室溫和充分混合，得到均勻的懸浮液。

Question：GERBU佐劑在第一次收集後的保質期是多長?

Answer：在冰箱無菌條件下存放至少1/2年。

Question：佐劑-抗原混合物呈泡沫狀/沈澱狀/塊狀。它還能被使用嗎?

Answer：不，因為期望的抗原性不再存在。此外，動物可能會受到傷害。

Question：GERBU佐劑與抗原混合後，這種乳劑在什麽條件下可以保存多久?

Answer：當佐劑與抗原混合時，應直接註射乳劑。如果抗原穩定，乳劑可在室溫下保存3個月。抗原/佐劑混合物的穩定性取決於抗原和緩沖液的性質。

與其它佐劑的比較FAQ

Question：GERBU佐劑的處理是否與弗氏佐劑(FCA/FIA)相當?

Answer：使用GERBU佐劑時，不需要用兩支註射器製備乳劑。兩種情況下抗原/佐劑的混合比例均為1:1。詳細說明請參閱協議。

Question：不同品種的GERBU佐劑的批號是否存在差異?也就是說，不同批次在體內產生抗體的速率不同嗎?

Answer：生產過程按GMP規範進行。所有的GERBU佐劑批號都要經過內部質量控製。檢查佐劑的具體參數是否在規定範圍內。特異性抗體滴度的產生不依賴於GERBU佐劑的特定批號。抗體的產生總是取決於動物的體質和所用抗原的性質。

Question：我之前使用的是GERBU佐劑10/100 / LQ。為什麽它不再可用?

Answer：當時的配方差別不大，主要在於包裝尺寸。我們進一步改進了配方，將三種產品合二為一。今天它被稱為佐劑P。

Question：我之前用了不同的佐劑。現在我想切換到GERBU。我可以簡單地繼續給動物註射GERBU佐劑嗎?

Answer：使用不同的佐劑系統會以意想不到的方式影響結果和動物的狀況。我們建議在更換佐劑之前暫停註射一段適當的時間，以使動物的免疫系統有時間再生。但在短期實驗中，無論如何不應改變佐劑。

特定應用FAQ

Question：通常會生成哪個抗體子類?

Answer：原則上，所有的抗體亞類都可以產生。實驗裝置必須作相應的調整。

Question：GERBU佐劑適合體外應用嗎?

Answer：根據我們的經驗，GERBU佐劑適用於產生重組抗體、嵌合抗體、合成抗體等。

Question：在體內使用GERBU佐劑是否可能在小鼠體內產生高質量和足夠數量的針對天然表位的單克隆和多克隆抗體?

Answer：可以與活性物質(靶標)結合的生物分子類型和所使用的免疫原的三級/四級結構對免疫反應有很大影響，即抗原的三維形狀及其復雜結構非常重要。

Question：我想使用GERBU佐劑進行商業抗體生產。除了產品價格外，我還需要支付許可費嗎?

Answer：GERBU佐劑是為商業用途而開發的。沒有額外的許可費。

Synaptic Systems（SySy）品牌成立於德國，專註於研發和生產針對突觸和神經科學相關抗體，以及用於細胞生物學、組織病理學和高分辨率顯微鏡的各種抗體，除此之外，還推出與SySy抗體配套使用的試劑盒、試劑等產品組合，全方面滿足客戶的各種需求。抗體產品線主要有：突觸活性區域相關抗體、突觸後蛋白相關抗體、RNA修飾如m6A抗體、突觸粘附蛋白抗體、SNARE相關抗體、Alzheimer's相關抗體、細胞骨架、離子通道相關抗體等。

那麽接下來為各位同學整理出常見問題，希望這能幫到您。（重組以及儲存）

1. 我應該如何重組抗體?

我們所有純化的抗體都是從PBS中凍幹的。

所以這也就解釋了為什麽好多同學疑問：我加了水以後到底是PBS溶液，還是正常溶液。

①為了在PBS中重組抗體，加入說明書中給出的去離子水的量。

所有的抗體都是在PBS中凍幹，加了水，也就變成了PBS溶液，加水復溶到對應濃度即可，然後分裝保存避免反復凍融~

如果需要更大的體積，按上述方法加水，然後加入所需量的PBS和穩定載體蛋白(如BSA)至最終濃度為2%。

註：由於一些抗體已經含有白蛋白。在添加更多的載體蛋白時要考慮到這一點。

②如果需要，添加少量叠氮化物或硫柳汞，以防止微生物生長。如果你想保持4°C的溫度儲存，特別建議這樣做！

③重組荧光標記抗體後，加入1:1 (v/v)的甘油至終濃度為50%。這降低了你的抗體的凝固點，使你的抗體在-20°C時保持液態。

註：甘油也可以添加到未標記的一抗中。這是一種避免凍融循環的合適方法。

2. 我應該如何儲存抗體?

收到抗體時：

我們所有的抗體和對照蛋白/肽都是凍幹(真空冷凍幹燥)粉末運輸的，在環境溫度下保持穩定，幾周內不會損失質量。

①未標記和生物素標記的抗體和對照蛋白在重組前應保存在4°C。當它們還在凍幹狀態時，千萬不要儲存在冰箱裏! 溫度低於0°C可能會導致性能下降。

②收到荧光標記抗體後應立即重組。長期儲存(幾個月)可能導致聚集。

③對照肽重組前，應保存在-20°C。

重組後的長期儲存(一般考慮)

①儲存冷凍室不能是無霜(“無霜冷凍室”)：這種凍結和解凍之間的循環(以減少結霜)，正是應該避免的。出於同樣的原因，抗體小瓶應放在冷凍室溫度波動最小的區域，例如靠後而不是放在門架上。

②將抗體等分，並冷凍保存(-20°C至-80°C)：避免非常小的等分(低於20ul)，並使用盡可能小的儲存瓶或管。等分越小，抗體在儲存瓶或管表面的蒸發和吸附對儲存液濃度的影響越大。

註：抗體在表面的吸附會導致活性的大量喪失。

③將甘油添加到最終濃度為50%時，並將抗體保持在-20°C的液態。這有效地避免了凍結和解凍循環。

產品存儲的具體提示

Control proteins / peptides

儲存於-20°C~ -80°C

Monoclonal Antibodies

Ascites和hybridoma supernatant應保存在-20°C ~ -80°C。

不建議在4°C下長時間儲存! 與血清不同，腹水可能含有蛋白酶，可降解抗體。
Purified IgG應保存在-20°C~ -80°C。添加像BSA這樣的載體蛋白會增加長期穩定性。我們的許多抗體已經含有載體蛋白。詳細資料請參閱數據表。

Polyclonal Antibodies

Crude antisera:添加抗微生物藥物後，可在4℃保存。 然而，最佳儲存(-20°C ~ -80°C)。

Affinity purified antibodies

不如抗血清穩定。建議在-20°C ~ -80°C下保存。添加像BSA這樣的載體蛋白會增加長期穩定性。我們的大多數抗體已經含有載體蛋白。詳細資料請參閱數據表。

Fluorescence-labeled Antibodies

用1:1 (v/v)甘油，在-20°C下保存。保護這些抗體免受光照。

重點：避免所有抗體重復凍融循環!

概述

3Helix由約翰霍普金斯大學（Johns Hopkins University）的2位博士Yang Li & Michael Yu成立，是一家專業研發、生產、銷售膠原蛋白雜交肽（collagen hybridizing peptides）的高科技公司。為科學家和臨床醫生提供新的工具來研究膠原蛋白病理，並開發具有高膠原蛋白重塑活性的疾病的診斷和治療方法。

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在科研和醫學診斷領域，準確檢測損傷膠原蛋白對於理解組織修復、疾病進展和治療響應至關重要。艾美捷科技在此分享關於新型多肽探針CHP檢測損傷膠原蛋白的原理、優勢及使用過程中可能遇到的常見問題。

CHP探針的適用性

Q1: CHP探針能否用於冰凍切片和石蠟切片染色？能否區分不同類型膠原蛋白？

A1: CHP探針適用於冰凍切片和石蠟切片的染色。它主要檢測受損的膠原蛋白分子，而不區分膠原蛋白的具體類型。

CHP產品的穩定性

Q2: CHP產品在4°C溶液中的穩定性如何？溶解後能否在-20°C或-80°C下分裝保存？

A2: CHP產品在4°C溶液中非常穩定，可保存一年而純度幾乎不下降。所有CHP產品均可在-20°C或-80°C下分裝保存，但無需分裝，因為肽在多次凍融循環後仍保持穩定。

CHP探針的使用

Q3: 是否每次使用CHP探針前都需要加熱？

A3: 是的，每次使用前都需要加熱CHP探針。加熱後的CHP探針在化學和物理上都非常穩定，但不建議加熱儲備溶液，以免多次熱冷循環。

染色操作的註意事項

Q4: 如果在組織切片染色時操作時間超過3分鐘，會有影響嗎？

A4: 操作時間超過3分鐘不會影響實驗結果。但建議盡量縮短CHP冷卻時間以及加入CHP試劑的操作時間，以獲得極高的結合率。

染色條件的選擇

Q5: 為什麽建議在4°C下進行CHP探針染色孵育？

A5: 在4°C下進行孵育可以增強CHP對變性膠原蛋白的親和力，並且適用於冷凍組織切片的染色。

固定劑和染色時間的選擇

Q6: 建議使用哪種固定劑或固定技術？染色結果是否取決於固定？

A6: 固定步驟不會決定染色結果。CHP染色不需要固定。如果需要固定，建議使用甲醛而非多聚甲醛或戊二醛。

共染色和抗原修復的影響

Q7: 如何在載玻片上進行CHP與抗體共染色？抗原修復是否會影響CHP染色？

A7: CHP與抗體共染色操作簡單，可直接混合後進行孵育。抗原修復處理會增強CHP染色，但建議在未經AR處理的組織上進行CHP染色以檢測自然降解或變性的膠原。

信號增強和對照選擇

Q8: 使用生物素標記的CHP（B-CHP）是否可以增強信號？

A8: B-CHP可以通過荧光標記的鏈黴親和素檢測增強信號。對於陰性對照，建議使用未經預熱的CHP溶液。

背景荧光的解釋

Q9: 為什麽在正常組織中會檢測到一些荧光？

A9: 在正常組織中檢測到背景荧光可能是由於CHP與天然組織中低含量降解膠原結合或組織的自發荧光。

推薦產品

艾美捷科技推薦以下產品用於膠原蛋白檢測：

· CHP探針

· 荧光標記的鏈黴親和素

· 甲醛固定劑

參考文獻

1. In situ imaging of tissue remodeling with collagen hybridizing peptides. ACS Nano, 2017, 11, 9825-9835.

2. Visualizing collagen proteolysis by peptide hybridization: From 3D cell culture to in vivo imaging. Biomaterials, 2018, 183, 67-76.

艾美捷科技致力於提供高質量的科研產品和解決方案，助力科研和醫學診斷的發展。如有任何疑問或需求，請隨時聯系我們。

       1.收到BioXCell產品後應如何處理？

收到抗體後，在分裝儲存及使用時需在生物安全櫃中進行，並使用無菌槍頭、離心管、註射器和緩沖液等，降低汙染率。另外，使用前抗體要處於低溫狀態。 

2.如何正確保存BioXCell抗體產品？

請將抗體置於4℃避光儲存。無菌操作。即使分裝後，也不推薦將抗體冷凍保存。避免將抗體稀釋至工作濃度後在4℃條件下儲存超過一天，建議現用現配。  

3.萬一沒註意說明書上的儲存要求，將抗體置於室溫儲存了一段時間，是否還可以繼續使用？

一般來說，室溫下放置幾個小時不會影響抗體的活性，但是放置幾天或者更長時間則有可能會導致蛋白降解，影響抗體活性，不建議使用。  

4.BioXCell抗體的保質期有多久？

按說明書要求儲存，BioXCell抗體有效期為1年。  

5.BioXCell抗體是凍幹粉還是液體形式？

BioXCell抗體均以無菌PBS緩沖液的形式提供。該溶液中不含穩定劑、防腐劑、載體蛋白、甘油或任何其他添加劑。抗體的pI值決定了PBS緩沖液的pH值。  

6.抗體收到後有漂浮物、絮狀沈澱或聚集物是否正常？應如何處理？

存在聚集物或沈澱物屬於正常現象，不會影響抗體的活性。可以在室溫下輕輕搖晃使其溶解，或過濾或離心去除。  

7.Bioxcell抗體的濃度是多少？BioXCell不同批次抗體的濃度不同，但一般來說是在4到11mg/mL之間。包裝的離心管上會標記抗體的具體濃度。如果需要在訂購之前知道產品的確切濃度，請聯系艾美捷科技。  

8.應如何稀釋抗體至工作濃度？

建議使用官網推薦的InVivoPure系列專用稀釋緩沖液來稀釋BioXCell抗體，艾美捷在每個產品頁面上都列出了每種抗體的推薦InVivo Pure 稀釋緩沖液。在沒有InVivoPure稀釋緩沖液的情況下，可以使用與抗體PBS緩沖液pH相同或相近的的無菌PBS，以避免蛋白聚集。稀釋時，建議使用預冷緩沖液，並在生物安全櫃中操作，使用無菌槍頭、試管、註射器和緩沖液來保持抗體的無菌性。應避免將抗體稀釋至工作濃度後在4℃條件下儲存超過一天。 

9.BioXCell抗體的氨基酸或DNA序列是什麽？

我們的抗體是使用標準雜交瘤技術生產的，因此抗體的AA或DNA序列通常是未知的。  

10.BioXCell抗體的抗原表位是什麽？

BioXCell不提供抗原表位信息，請客戶自行參考文獻。  

11.BioXCell抗體在體內的半衰期是多久？

廠家內部並沒有抗體在體內的半衰期數據。因為抗體的半衰期是高度可變的，並且受到物種、同型、抗原分布、抗原濃度和許多其他因素的影響。建議閱讀感興趣抗體已發表的相關文獻，參考與您實驗條件及設計相近的實驗數據，預估抗體的半衰期。 

12.BioXCell抗體是否適用於體內註射實驗？

BioXCell所有的產品都是專門為體內使用而配製的。所有抗體均在無菌 InVivoPure緩沖液中配製。抗體溶液不含穩定劑、防腐劑、載體蛋白、甘油或任何其他添加劑。內毒素水平 <2EU/mg ( InVivoMab)，這使它們有資格進行大多數體內研究。為了滿足最嚴格的要求，BioXCell還提供內毒素水平較低的抗體：<1EU/mg ( InVivoPlus)。  

13.BioXCell抗體是否適合體外應用？

可用於體外應用，例如細胞培養實驗和診斷測定，包括蛋白質印跡、免疫沈澱、IHC、流式細胞術等。請參閱各個產品頁面以獲取已批準的列表每種抗體的應用。另外所有BioXCell抗體都是未偶聯的，因此流式細胞術和免疫荧光等應用需要使用荧光染料偶聯的二抗。  

14.小老鼠體內註射實驗，應該多久註射一次？每次註射多少抗體？？

任何給定實驗和抗體的最佳給藥劑量和頻率可能會因實驗系統（即小鼠品系、疾病模型等）、實驗持續時間、靶組織、抗原濃度和許多其他因素而有很大差異細節。出於這個原因，最佳劑量最好通過閱讀與您感興趣的抗體相關的產品參考文獻來確定，以查找與您的實驗系統類似的實驗系統中的已發布數據。以此現有研究為起點，您可以通過實驗優化給藥劑量和頻率。BioXCell的每種產品在產品網頁上都有最新的參考列表。  

15.體內實驗中同種型對照組是否重要？如何選擇合適的同種型對照？

考慮同型對照處理組需要生成可靠的數據，因為它允許研究人員準確地區分以抗原特異性方式從初級抗體結合觀察到的結果和從非抗原特異性結合或抗體註射的其他非特異性作用觀察到的結果。同型對照抗體必須與一抗的宿主物種、同種型和亞類相匹配。為了方便我們的客戶，我們在每個產品頁面上列出了每種抗體的推薦的同型對照貨號。  

16.如果覺得自己的抗體效果不佳，怎麽辦？

如果您懷疑您的抗體沒有發揮最佳功能，請務必認真填寫並提交技術服務申請表。您填寫的實驗信息越充分，BioXCell技術團隊的建議才更可靠。  

17.如何申請和查詢產品的COA？

官網自助鏈接：https://apps.bioxcell.com/certificate-of-analysis 

18.應該如何購買BioXCell抗體？

艾美捷科技是BioXCell中國區代理，歡迎咨詢購買：400-6800-868  

19.Bioxcell InVivoMab和InVivoPlus兩種級別的抗體有什麽區別？

尊敬的客戶：

感謝您選用艾美捷科技代理品牌的產品，您的信任和支持是我們的動力！ 

您可能註意到了部分產品的運輸條件和保存條件不一致，也許這會讓您擔心產品的質量。我們非常 理解您的顧慮，對此我們特別說明如下： 

運輸條件是根據在短期運輸過程中不影響產品質量的原則，經由對應品牌廠家測試後製定的，可能 有別於推薦的長期儲存條件（為了更長的保存時間）。某些產品在短期內（如運輸時）不按長期保存條 件保存並不會影響到其質量。而那些在短期內對溫度條件敏感的產品則將加藍冰（冰袋）或幹冰運輸， 以防止溫度驟變給產品穩定性造成影響。 

客戶在收到產品包裹的時候，冰袋會出現融化的正常現象，它主要在整個運輸過程中起到延緩溫度 驟變的作用，廠家生產試劑時會有穩定性處理，不會影響效能。 

絕大部分試劑在實驗開始前，需要將試劑恢復到室溫。如果您收到貨時溫度為常溫，不用擔心，這 些都在廠家產品開發時的考慮範疇內。如果當日即用，就不用再解凍可以盡快實驗，如當下不用，就盡 快按照產品長期儲存溫度保存即可，如果後續是多次使用則建議先分裝後再保存，避免多次反復凍融。 如使用中遇到問題可以及時聯系艾美捷科技。 

艾美捷以產品的品質為第一位，完全按照品牌廠家的運輸條件執行，以最大的努力滿足客戶，贏得客戶信賴。如您有任何關於產品保存和運輸條件相關的疑問，請撥打我司服務熱線：400-6800-868 或 027-59626688，我們將竭誠為您服務。 

此致，

敬禮！

武漢艾美捷科技有限公司         時間：2022 年 8 月 18 日星期四

儲存：凍幹粉原裝儲存在 2-8℃（不開封原裝保存 3-5 年）。

溶解：加入一定體積 dH2O（參考特定說明書），溶解完全。工作液現用現配。

保存：

（短期保存）未稀釋的液體，在 2-8℃下穩定約 6 周；

（長期保存）

方法一、水化後分裝，置於-70°C 或以下冷凍保存，避免重復凍融。

方法二、添加等體積的甘油(ACS 級或更高)，終濃度變為原來的 50%，以液體形式儲存於-20℃。

註意：加入甘油後使蛋白質濃度和稀釋的範圍都減半（比如：重溶後抗體的濃度是 0.8mg/ml，

體積 2ml，抗體稀釋比例 1:5,000 - 1:100,000 for WB, 加入等體積（2ml）的甘油後, 抗體濃

度變成 0.4mg/ml，體積 4ml,抗體稀釋比例變成 1:2500-1:50000 for WB）。

水化後保質期：自補水之日起一年。如果測試結果符合預期用途，則可以延長有效期

我們知道，ProSpec 相當一部分細胞因子和蛋白為凍幹粉，這使得運輸非常便捷，只要常溫即可。而且，細胞因子和蛋白 凍幹粉非常穩定，在-20℃或-80℃條件下可保存數年。凍幹粉在使用前需進行溶解，然後以液體形式加到培養體系。溶解步驟非 常關鍵，因溶解不好會導致細胞因子或蛋白的失活，這也是很多用戶在實際使用中經常遇到的問題。

那麽，應該如何進行正確的溶解呢？ 

下面我們以 Recombinant Human IL-4 (重組人 IL-4，產品編號：CYT-211)的說明書為例，對細胞因子或蛋白的溶解方法 進行詳細的闡述。 

拿到重組人 IL-4 的說明書後，您會發現有一段關於 Reconstitution(重懸)的敘述，這段內容含有溶解相關的所有信息。

1. Centrifuge the vial prior to opening  

第 1 步：開盖前離心試劑管 

ProSpec 的細胞因子或蛋白凍幹粉裝盛在塑料管中，為無菌包裝。凍幹粉在運輸過程中可能會因顛簸而漂散並粘貼於管壁 或管盖上，所以在打開塑料瓶盖前，需將凍幹粉通過離心收集到管底，以便用很小體積的液體即可將凍幹粉完全溶解。 

有很多用戶會問一個問題，即應該用多少轉速、多長時間離心試劑管，才能達到良好的收集效果？ 

答：有些小型高速離心機(多為進口品牌)的面板上有一個 Spin 鍵，按了此鍵後，離心機會自動快速上升到其最大速度 (10000rpm 或 12000rpm)，上升到最高點後速度即刻下降，直至停止旋轉，整個過程大約 30s。這個 Spin 鍵足以很好的將細 胞因子或蛋白收集到管底。但有些實驗室沒有這樣的高速離心機，只有最高轉速為 4000-4500rpm 的離心機。這種情況下，需 3000-3500rpm 離心 5min，也能達到類似的效果。

2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do notvortex. 

第 2 步：用無菌水重懸至 0.1-1.0 mg/ml，不可振蕩。 

這個步驟即為溶解步驟，非常重要。 

1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍幹粉 

用於溶解細胞因子或蛋白的溶液千差萬別。此例中的重組人 IL-4 需用水溶解，而重組人 IL-2 (產品編號：CYT-209)則需用 20mM Acetic Acid (醋酸)溶解，重組人 TGF-beta1(產品編號：CYT-716）需用 10mMAcetic Acid (醋酸)溶解 (註：即使同一 重組細胞因子或蛋白，不同批次的溶解方法也可能有所不同，因此上面的敘述僅供參考。具體應該如何溶解應以相應批次的官方 說明書為準)。後續的文章中將對各種溶解液的配製方法進行詳細的闡述，望繼續關註。 

經常有用戶會問，為什麽會有這麽多種溶解方法？ 

答：我們知道，蛋白的溶解性與很多因素有關，其中比較重要的是 pH 值和離子強度。ProSpec 的細胞因子或重組蛋白在 出廠前均經嚴格測試，說明上所標明的溶解液是能夠將該細胞因子或重組蛋白完全溶解的液體。如果您所用的溶解液的 pH 值和 離子強度與說明書中所標明的不符，很多時候會造成細胞因子或重組蛋白不能完全溶解或者根本無法溶解，這樣所配得的細胞因 子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。 

有不少用戶沒註意說明書上的描述，而是根據習慣，直接用 PBS 或培養液(1640 或 DMEM 等)等溶解細胞因子或蛋白的 凍幹粉。這樣做可以嗎？

答：有時可以，要看具體情況。ProSpec 的大多數細胞因子或蛋白凍幹粉的溶解液不是 PBS，此時千萬不能用 PBS 或培 養液直接來溶解，具體原因在上面已經敘述過。而有部分細胞因子，如重組人 KGF 和重組人 FGF-23 等，說明書上的溶解液即為 1x PBS，此時用 PBS 溶解完全沒問題，那麽用培養液溶解也是可以的，不過最好還是用先用 PBS 溶解，然後再用培養液稀釋。 

2) 一定要溶解到指定的濃度。 蛋白在一定的濃度範圍內可以保持良好的穩定性，這個範圍就是說明書上所標明的濃度範圍，該例為 0.1-1.0mg/ml。 這個濃度範圍對於不同的細胞因子或重組蛋白是不同的。 

高於或低於該濃度範圍會有什麽問題呢？ 

答：首先，細胞因子或蛋白會不穩定，即很容易出現活性下降的現象。其次，高於這個濃度範圍，可能會超過該蛋白的 最大溶解濃度，即蛋白無法完全溶解。再者，高於或低於該濃度範圍，蛋白可能會出現聚集(aggregation)，最終結果還是部分 蛋白未溶解，導致蛋白活性的減弱。 

3) 一定不能振蕩(vortex)。 

這裏所說的振蕩是指用渦旋儀進行快速振蕩。 

有用戶會問，若想保證溶解液與凍幹粉充分混勻，以實現細胞因子或重組蛋白的完全溶解，該怎麽辦呢？

答：多數細胞因子或重組蛋白的凍幹粉是非常容易溶解的，一般我們用移液槍的槍頭輕吹幾下，即可使細胞因子或重組 蛋白完全溶解。 

對於不易溶解的細胞因子或蛋白，ProSpec 會在說明書中進行備註。這種情況下，您最好能將要溶解的細胞因子或重組 蛋白放在水平搖床(shaker)上低速搖一段時間，促使細胞因子或重組蛋白完全溶解。 

3. This solution can be stored at 2-8℃ for up to 1week. 

第 3 步：該重懸液在 2-8℃最長可保存 1 周。 

用說明書上推薦的溶液將細胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度後，細胞因子或重組蛋白可放置在 2-8℃，即冰箱的冷藏室。 在這種條件下，細胞因子或重組蛋白的活性最長可保持 1 周。這對一個周期為 5-7 天的實驗，如 DC(樹突狀細胞)的誘導成熟是 足夠的。在此期間，只要每次從冰箱裏吸取一定量的細胞因子或重組蛋白溶液加入到培養體系內即可。 

其實，說明書上推薦的濃度對於一般的實驗來講是比較高的。所以用戶通常會將該溶液進一步稀釋後再放在 4℃保存，待 1 周內用完。如進行稀釋，必須遵照下面第 4 步的方法，即需用含載體蛋白的溶液進行稀釋，否則稀釋後的細胞因子或重組蛋白很 容易會粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的細胞因子或重組蛋白的濃度下降，細胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。

4. For extended storage, it is recommended to further dilute in abuffer containing a carrier protein (example 0.1%  BSA) and store in workingaliquots at -20℃ to -80℃. 

第 4 步：如要長期保存，則需用含載體蛋白(如 0.1% BSA，或 10% FBS，或 5% HSA)的溶液進一步稀釋，然後分裝凍存於-20℃ 至-80℃。 

如果一個實驗周期長於一周，或配製的細胞因子或重組蛋白一次用不完，我們就需對細胞因子或重組蛋白進行長期保存。 方法是：將已重懸的細胞因子或蛋白用含載體蛋白，如 0.1%BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS(胎牛血清)，5% HSA(人血清白蛋白) 的溶液將重懸液進一步稀釋，然後分裝凍存於-20℃至-80℃，即常規冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。 

經常有人會在細胞因子或重組蛋白凍幹粉用推薦的溶液重懸後直接分裝凍存於-20℃至-80℃，這樣可以嗎？ 

答：不行。我們知道，塑料管壁對多數蛋白均有很好的吸附作用，也就是說溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附後， 蛋白是很難與管壁分離的。做過 ELISA 實驗的人都知道，ELISA 的包被抗體(Capture antibody)就是通過這種粘附作用包被到酶 標板上的。 

載體蛋白，如 1% BSA，10% FBS(胎牛血清)和 5% HSA 等的主要作用是預先封閉塑料管壁上的蛋白結合位點，使細胞因子 或重組蛋白不會粘附於管壁。如果在細胞因子或重組蛋白凍幹粉用推薦的溶液重懸後不用含載體蛋白的溶液進一步稀釋，而直接 分裝凍存，則溶液中的大部分細胞因子或重組蛋白均會粘附到管壁上，導致溶液中實際溶解的細胞因子或重組蛋白的濃度大為降 低，最終表現為細胞因子或重組蛋白活性的下降。 

因此，在分裝凍存前，一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進一步稀釋。稀釋後的細胞因子或重組蛋白可為任意濃度，因大 量的載體蛋白可以保證低濃度細胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩定性。 

那麽，含載體蛋白的溶液指的是什麽溶液呢？水可以嗎？ 

答：水不可。該溶液通常是指 pH 近中性，有一定緩沖能力的緩沖液，如 PBS，培養液(RPMI1640, DMEM 等)等。 

還有一個經常被問及的問題，即在做無血清培養或動物的體內實驗時，細胞因子中不能含有 BSA，FBS 或 HSA 等動物或 人的蛋白，要想長期保存細胞因子或重組蛋白該怎麽辦呢？ 

答：一種方法是訂購 ProSpec 的小包裝細胞因子或重組蛋白，每次使用一只，用後即廢棄。

5. 後續稀釋液的配方：即原產品的溶液的配方。 

總之，為保證細胞因子或重組蛋白凍幹份在重懸後仍能保持良好的生物活性，必須按照說明書中 Reconstitution 的方法 嚴格操作。 

蛋白有價，實驗無價，願大家珍惜每次實驗機會，嚴謹認真，每次均能得到預期的實驗結果！