Agrisera：Anti-BirA (mutated/TurboID) 抗體

文章解析：《Proximity-dependent mapping of the HCMV US28 interactome identifies RhoGEF signaling as a requirement for efficient viral reactivation》

鏈接：https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1011682

人巨細胞病毒（Human Cytomegalovirus，HCMV）是β-疱疹病毒家族中最大的成員，全球大多數人口均受其感染。HCMV感染通常在初次感染後表現為無癥狀，並能在髓系細胞中建立終身潛伏感染。在潛伏期間，病毒會持續存在於宿主體內，主要在骨髓中的造血祖細胞（Hematopoietic Progenitor Cells，HPCs）內。由這些HPCs生成的潛伏感染單核細胞被認為是病毒傳播到身體其他組織的主要細胞庫。對於免疫功能低下的人群，如移植受者和艾滋病患者，病毒的再激活事件可能引發危及生命的健康並發癥，包括器官衰竭和移植物排斥。

盡管已經發現多個細胞信號通路與HCMV的潛伏和再激活有關，如EGFR、PI3K/AKT、MAPK、TGF-β、Src、ERK、Rho和Wnt通路，但參與建立潛伏和再激活潛能的確切信號機製仍不清楚。此外，目前美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的HCMV抗病毒藥物往往具有毒性作用，且主要針對病毒復製晚期，即臨床癥狀已經出現時。因此，為了發現HCMV的額外治療選項，闡明介導病毒潛伏和再激活的分子機製至關重要。

HCMV編碼四種推定的G蛋白偶聯受體（G Protein-Coupled Receptors，GPCRs），它們與細胞趨化因子受體具有同源性，其中US28是迄今為止研究最深入的。US28在潛伏期和再激活期間均在感染的人外周血細胞中表達，並參與細胞增殖、分化和遷移等多種生物學過程的調控。盡管已知US28對於HCMV的潛伏/再激活至關重要，但參與這些過程的具體細胞信號通路尚未完全明確。

方法

為了深入探究US28在HCMV潛伏和再激活中的信號傳導機製，本研究采用了鄰近依賴的生物素化酶（TurboID）技術來表征US28在孤立表達、潛伏感染（CD34+ HPCs）和裂解感染（成纖維細胞）期間的相互作用網絡（interactome）。TurboID技術是一種基於生物素連接酶BirA的鄰近標記方法，它能夠在空間上接近目標蛋白的蛋白質上共價添加生物素標簽，從而允許通過質譜分析來識別這些相互作用蛋白。

實驗中使用的關鍵試劑：

Anti-BirA (mutated/TurboID) 抗體（貨號：AS20 4440，Agrisera品牌）：該抗體專門用於檢測和驗證TurboID融合蛋白的表達和活性。在實驗中，它用於確認TurboID標簽已成功融合到US28蛋白上，並確保鄰近依賴的生物素化反應能夠正常進行。這一步驟對於後續通過質譜分析準確識別US28的相互作用蛋白至關重要。

實驗

構建TurboID-US28融合表達載體：首先，研究人員構建了表達TurboID-US28融合蛋白的載體，並將其轉染到目標細胞中。

鄰近依賴的生物素化：在TurboID-US28融合蛋白表達後，細胞被處理以允許TurboID酶催化鄰近蛋白的生物素化。這一步驟使得與US28空間上接近的蛋白質被標記上生物素。

質譜分析：接下來，利用質譜技術對生物素化的蛋白質進行鑒定，從而揭示US28的相互作用網絡。

功能驗證：通過免疫印跡（immunoblot）和小分子抑製劑實驗，對質譜分析鑒定出的關鍵相

互作用蛋白進行功能驗證。特別地，本研究關註了RhoGEFs（Rho Guanine Nucleotide Exchange Factors）作為US28信號轉導的重要中介體。體外和體內再激活實驗：利用原代CD34+ HPCs和人源化小鼠模型，研究人員評估了RhoGEF抑製劑（如Rhosin和Y16）對HCMV再激活的影響。

結果與結論

本研究通過鄰近依賴的TurboID技術，成功繪製了US28在孤立表達、潛伏感染和裂解感染期間的相互作用網絡。質譜分析顯示，US28信號復合體與RhoA和EGFR信號轉導通路存在顯著重叠，共享多個在細胞增殖和分化等過程中起主要作用的介質。特別地，研究發現了RhoGEFs作為US28信號轉導的關鍵中介體。RhoGEFs是RhoGTP酶的激活劑，它們直接連接細胞表面受體（如US28）和RhoA的激活，從而調控細胞遷移、分化等生物學過程。通過功能驗證實驗，研究人員證實了RhoGEFs在US28信號轉導中的重要作用。

進一步地，在體外和體內再激活實驗中，使用RhoGEF抑製劑（Rhosin和Y16）處理原代CD34+ HPCs和人源化小鼠模型，結果顯示這些抑製劑顯著抑製了HCMV的再激活。這一發現不僅驗證了RhoGEFs在US28介導的病毒再激活中的關鍵作用，也為開發針對HCMV的新型抗病毒藥物提供了潛在的靶點。

Anti-BirA (mutated/TurboID) 抗體的作用和價值：

在本研究中，Agrisera品牌的Anti-BirA (mutated/TurboID) 抗體（貨號：AS20 4440）發揮了至關重要的作用。首先，該抗體確保了TurboID-US28融合蛋白的成功表達和正確融合，這是整個實驗的基礎。通過特異性地識別TurboID標簽，該抗體允許研究人員在細胞水平上驗證融合蛋白的存在和活性，從而確保了後續鄰近依賴的生物素化反應的有效性和準確性。

其次，該抗體的使用提高了實驗的特異性和靈敏度。在復雜的細胞環境中，確保TurboID標簽的特異性識別對於減少背景噪音和假陽性結果至關重要。Agrisera的Anti-BirA (mutated/TurboID) 抗體以其高特異性和親和力，為研究人員提供了可靠的工具來檢測和驗證TurboID融合蛋白的表達，從而確保了實驗結果的準確性和可靠性。

最後，該抗體的應用為後續的功能驗證實驗奠定了基礎。在確認TurboID-US28融合蛋白成功表達後，研究人員能夠利用質譜技術鑒定出與US28相互作用的蛋白質，並通過免疫印跡等實驗方法進一步驗證這些相互作用。這一過程不僅揭示了US28的相互作用網絡，也為理解HCMV潛伏和再激活的分子機製提供了寶貴的線索。

綜上所述，Agrisera品牌的Anti-BirA (mutated/TurboID) 抗體（貨號：AS20 4440）在本研究中發揮了不可替代的作用，它不僅確保了實驗的成功進行，還為揭示HCMV潛伏和再激活的分子機製提供了有力的技術支持。這一發現不僅加深了我們對HCMV生物學特性的理解，也為開發針對該病毒的新型抗病毒藥物提供了潛在的靶點和治療策略。